脈沖場凝膠電泳
當(dāng)雙鏈DNA分子超過一定的大小以后,DNA雙螺旋的半徑超過了凝膠的孔徑,在瓊脂糖中的電泳速度會達(dá)到極限,此時凝膠不能按照分子大小來篩分DNA,脈沖場電泳就解決了這一難題
脈沖電泳是在兩個不同方向的電場,周期性交替進(jìn)行的,DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間顯著地依賴于分子大小,DNA 越大,這種構(gòu)象改變需要的時間越長,重新定向的時間也越長,于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少,因而在凝膠中移動越慢。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子
脈沖場凝膠電泳
1 儀器: WD-2101A脈沖電泳系統(tǒng)
2 配套試劑:脈沖電泳專用瓊脂糖(SeaKem Gold Agarose)、TBE
3 染料:GelRed等
在凝膠電泳中,溫度越高,DNA移動的速度越快,但是條帶的清晰度和分辨率會明顯下降。溫度過高會導(dǎo)致DNA帶變形或解鏈,一般設(shè)置電泳溫度為14℃
常用緩沖液是0.5×TBE H9812,2.2s-63.8s,19h
脈沖場電泳常見問題及解決辦法
1)凝膠在緩沖液中漂浮–蠕動泵的速度太快或太慢, 調(diào)到合適的速度
2)緩沖液不流動或流速慢–檢查冷卻泵:當(dāng)冷卻泵制 冷時,如果蠕動泵沒有開,會造成管道內(nèi)結(jié)冰,導(dǎo) 致管道堵塞
3)電泳條帶扭曲–流速太低,導(dǎo)致制冷不充分,或不 均一、緩沖液的體積不能太小
4)條帶變粗–減少上樣量
5)條帶拖尾或模糊–電場轉(zhuǎn)換時間不合適,優(yōu)化轉(zhuǎn)換 電場轉(zhuǎn)換時間、上樣量太高,調(diào)整樣品濃度
6)大片段DNA不能有效分離–將低電壓、延長電場轉(zhuǎn)換 時間
7)條帶彎曲–緩沖液緩沖能力下降,更換緩沖液、上 樣時樣品塊被擠碎、泵速度太慢
聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在引發(fā)劑(eg.APS)和加速劑(eg.TEMED)的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠,以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)。
聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點:
1 在一定濃度時,凝膠透明,有彈性,機(jī)械性能好。
2 化學(xué)性能穩(wěn)定,與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
3 對pH和溫度變化較穩(wěn)定。
4 幾乎無電滲作用,只要Acr純度高,操作條件一致,則樣 品分離重復(fù)性好。
5 樣品不易擴(kuò)散,且用量少。
6 凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。
7 分辨率高,尤其在不連續(xù)凝膠電泳中,集濃縮、分子篩和 電荷效應(yīng)為一體,因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電 泳等有更高的分辨率。
聚丙烯酰胺凝膠聚合
聚合原理
1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下合成的。 催化系統(tǒng)常用有兩種: 過硫酸氨—TEMED化學(xué)催化聚合系統(tǒng) 此系統(tǒng)中,四甲基乙二胺(TEMED)稱為加速劑,它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入,可使過硫酸氨(APS,引發(fā)劑)形成自由基。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應(yīng),形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。
2. 核黃素—TEMED光聚合催化系統(tǒng) 此系統(tǒng)中,核黃素經(jīng)紫外線光解形成無色基,再被痕量氧氧化形成自由基,引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在,可以加速聚合,本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置。
凝膠孔徑的可調(diào)性及性質(zhì)
1)聚丙烯酰胺凝膠的孔徑的大小是由單體和雙體在凝膠中的總濃度(T),以及雙體占總濃度的百分含量(C)即交聯(lián)度決定的。通常凝膠的篩孔、透明度和彈性是隨著凝膠濃度的增加而降低的,而機(jī)械強(qiáng)度卻隨著凝膠濃度的增加而增加。
2)凝膠濃度與孔徑的關(guān)系: T與C不僅與凝膠的機(jī)械性能有關(guān),還與凝膠的孔徑關(guān) 系極為密切。一般講,T濃度大,孔徑小,移動顆粒 穿過網(wǎng)孔阻力大。此外,孔徑還同Acr與Bis的比例有 關(guān),Bis占Acr總濃度5%時,孔徑最小。
3)凝膠濃度與被分離物相對分子量質(zhì)的關(guān)系:由于凝膠濃度不同,平均孔徑不同,能通過可移動顆粒的相對分子質(zhì)量也不同。在操作時,可根據(jù)被分離物相對分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標(biāo)準(zhǔn)膠),因為生物體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得較滿意的結(jié)果。如分析未知樣品時也可用4%-10%的梯度膠測試,根據(jù)分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。
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本文關(guān)鍵詞:脈沖場凝膠電泳,DNA電泳